1.2. Los métodos de enriquecimiento, aislamiento y cultivo de los Planctomycetes.

• Los bajos niveles de nutrientes o enriquecimiento oligotrófico se han utilizado como un paso primario en el aislamiento de determinados organismos de ambientes acuáticos. 

• El uso de estos nutrientes bajo los enriquecimientos llegó desde el método de Houwink (en 1951), quien añadió, que las bajas concentraciones de peptona al 0,01 % de muestras de agua, son para el eniquercimiento y aislamiento de Caulobacter spp.

• Este mismo enfoque, se hizo con el 0.01% o el 0.005% de peptona y el 0,005% de extracto de levadura en combinación, se utilizó posteriormente para enriquecer y aislar Proteobacteria prosthecate, así como cepas de Planctomycetes.

• Estos enriquecimientos líquidos se incubaron a temperatura ambiente y se examinaron con ayuda del microscopio después de 1 a 2 semanas o más para la evidencia de brotación de bacterias que parecen ser miembros del Filo Planctomycetes.

• A esto se le hizo un inóculo de enriquecimiento los cuales se pueden sembrarse en medios oligotróficos sólidos similares para su aislamiento. Después de ello, se realizó un extendido de incubación de muestras de agua sin la adición de nutrientes, esto se desarrolló en la oscuridad para evitar el crecimiento de cianobacterias y algas, también se ha utilizado con éxito en el enriquecimiento de las cepas Planctomycetes.

• La mayoría de Planctomycetes no son estrictamente oligotróficos, y aunque muchos de ellos residen en hábitats acuáticos relativamente bajos en nutrientes, sino que también se encuentran en aguas eutróficas, suelos, aguas residuales y otros ambientes ricos en nutrientes.

• En particular, en una encuesta de unos lagos oligotróficos australianos mesotróficos y varios estanques, así como eutróficos, las concentraciones viables del grupo Planctomycetes se encontró que eran más altos en los estanques eutróficos, donde su número era tan alto como 240 por ml.  Sin embargo, sus números de relación al total de heterótrofos viables permaneció similar independientemente del estado trófico (Staley et al. 1980).

• No obstante, todos los Planctomycetes tienen relativamente una larga generación y como tal, el enriquecimiento en soluciones diluidas favorece el crecimiento de Planctomycetes, donde el uso de medios ricos en nutrientes puede resultar el crecimiento excesivo de bacterias que se dividen rápidamente.

• Bajo el enriquecimiento de nutrientes se ha aplicado con éxito en el aislamiento de un número de cepas Planctomycetes de agua dulce y ha demostrado ser una técnica muy eficaz para el aislamiento de Planctomycetes de suelo, donde el crecimiento excesivo de hongos puede resultar una problemática.  

• Las cepas marinas se han aislado con éxito utilizando peptona diluida en un medio de enriquecimiento artificial con el agua de mar y en agar marino disponible en el mercado.

• Notablemente, el tipo de cepa de la especie Isosphaera pallida, una verdadera oligotrófica, se aisló inicialmente en un medio sólido adecuado para autótrofos, sin la adición de cualquier fuente de carbono orgánico específico.

• Este organismo es quimioheterótrofo en lugar de ser autótrofo en su metabolismo, aparentemente era capaz de sobrevivir y multiplicarse utilizando sólo contaminantes orgánicos dentro del agar.

• Las pruebas específicas de I. pallida cepas en una variedad de fuentes de carbono indican que el crecimiento de este organismo se inhibe por concentraciones de glucosa de solo 0,05%.
• Algunas cepas también son inhibidas por concentraciones bajas de la ribosa, fructosa, maltosa o glicolato.

• La capacidad de algunos géneros Planctomycetes es adherirse a las superficies a través de una estructura de disco basal, también se ha explorado en algunas técnicas de aislamiento tales como el “método de la placa de Petri” de Hirsch y Müller (1986).

• En este método, se coloca un cubreobjetos de vidrio estéril en posición vertical en una placa de Petri que contiene la muestra de agua de interés y se incuba durante varios días, los cuales permiten a los organismos Planctomycetes insertarse en el vaso.

• El cubreobjetos se coloca con la cara abajo en un agar que contiene nutrientes que permiten a las colonias desarrollarse.

• Más recientemente, esta técnica se ha combinado con métodos de detección molecular para el aislamiento de Planctomycetes cepas de turba ácida.

• En ese estudio, se enriquecieron en Planctomycetes los cubreobjetos que fueron sumergidos en agua de la turba y de hibridación fluorescente, empleando sondas Planctomycetes específicas, se utilizan para controlar el enriquecimiento de Planctomycetes dentro de las biopelículas de los cubreobjetos.

• El método de placa de Petri se ha utilizado con éxito para el aislamiento de cepas que poseen Planctomycetes discos de fijación, Pirellula spp.  

• La morfología distintiva de muchos Planctomycetes, es relativamente grande al tamaño de celda y/o tendencia a formar rosetas, permite su identificación presuntiva dentro de una muestra compleja.

• El aspecto distintivo de estos organismos puede ser explotada en su aislamiento mediante el uso de Microtools.

• La Micromanipulación, es una técnica que emplea una herramienta fina de vidrio unido a una lente de baja potencia microscópica, y las fuerzas de tensión superficial (Skerman 1968) permitieron la captura y el posterior cultivo de células de Gemmata obscuriglobus (Franzmann y Skerman 1984) y Candidatus 'Nostocoida limícola III '.

• Más métodos modernos pero equivalentes, tales como las pinzas de uso óptica (láser) o la encapsulación de microgotas de gel, son potencialmente prometedoras las técnicas para el aislamiento de cepas Planctomycetes no cultivadas.

• El aumento de los conocimientos sobre la ecología y fisiología de Planctomycetes ha facilitado el desarrollo de los medios selectivos para su aislamiento, y un estudio exhaustivo de las técnicas de enriquecimiento y aislamiento quimioheterótrofo selectivos por Schlesner (1994) dio como resultado el aislamiento de una gran colección de Planctomycetes de diversos hábitats acuáticos que varían en salinidad, pH y los niveles de nutrientes.

• Un hallazgo notable de este estudio fue la capacidad de muchas de estas cepas para utilizar N-acetil-D-glucosamina como única fuente de carbono y nitrógeno.

• N-acetil-D-glucosamina es el constituyente básico de la quitina, lo que puede explicar la asociación observada de algunos Planctomycetes con organismos de quitina tales como Daphnia sp. (“agua de las pulgas”), el camarón tigre gigante, Penaeus monodon, diatomeas, las termitas (Cubitermes spp.), Así como los agregados de detritos marinos ricos en carbono conocidas como “nieve marina”. 

• El descubrimiento de los Planctomycetes posee una estructura única de la pared celular proteico que carece de la característica (casi universal) bacteriana, peptidoglicano, Schlesner llevó a incorporar a la ampicilina en su medio selectivo.

• De hecho, la resistencia inherente de Planctomycetes a ß-lactámicos se destaca por el aislamiento fortuito de una nueva cepa de una solución de ampicilina en el laboratorio que no habían sido esterilizados.

• Mediante el empleo de medios que contienen N-acetil-D-glucosamina o peptona, extracto de levadura y glucosa combinada con ampicilina y ciclo heximida para minimizar el crecimiento de bacterias y hongos, Schlesner fue capaz de aislar un total de 256 nuevas cepas Planctomycetes de diversos hábitats incluyendo oligotróficas eutróficas y solución salina de estanques, acuarios marinos, estiércol, aguas residuales, agua y tiza mina de yeso, un lago antártico y la jarra de un Nepenthes spp.

• Posteriormente, los medios selectivos que contienen combinaciones de agentes antibióticos tales como D-cicloserina, penicilina o ampicilina y estreptomicina o cloranfenicol, a la que Planctomycetes, también son inherentemente resistentes, y agentes antifúngicos tales como ciclo heximida, anfotericina B o benomilo, se emplearon con éxito en el aislamiento de Planctomycetes de agua dulce, de suelo y una turbera ácida. 

• Un método de cultivo mejorado diseñado específicamente para el aislamiento de cepas Rhodopirellula, también se ha desarrollado, por lo que la materia particular está incluyendo gránulos de sedimentos, plancton o biopeliculas raspados se cultivó en placas sobre agar selectivo.

• Los Planctomycetes se adhieren a las partículas y se encontró a mejorar considerablemente el rendimiento de las nuevas cepas. 

• La notable diversidad dentro de la Planctomycetes y su capacidad para ocupar nichos ecológicos dispares se ha convertido cada vez más evidente con cada nuevo aislado de un cultivo puro. 

• En algunos casos, el aislamiento de una sola especie ha necesitado la creación de un nuevo género en su totalidad (o clase) para acomodarlo. Encuestas moleculares de diferentes ecosistemas en todo el mundo indican que la diversidad no cultivada sustancial todavía existedentro de los Planctomycetes; Sin embargo, las cepas más cultivadas aisladas hasta ahora comprenden quimio heterótrofos aeróbicos de la clase Planctomycetia.

• No obstante, hay indicios de que incluso la clase Planctomycetia puede ser más diversa de lo que fisiológicamente presentes métodos de aislamiento. 

• El hecho de que el miembro de la Planctomycetia se detectó a través de métodos moleculares en el anaeróbica y Zodletone sulphurrich primero se plantea la cuestión de si estos organismos podrían ser capaces de la respiración de azufre elemental. 

• Está claro que las cepas cultivadas reflejan los métodos utilizados para aislar, y sí una gama más amplia de representantes planctomycetes son ser cultivadas axénicamente.

En la identificación de Planctomycetes en muestras ambientales con 16S rRNA sondas dirigidas. campos microscópicos idénticos se han visualizado usando el filtro de conjuntos específicos de DAPI (panel izquierdo) y Cy3 (panel de la derecha. (A) Agregado de pirellulae sobre una partícula fitodetritus en una muestra de agua del lago Felder Ver hibridó con sonda PIR 1224. (Bar, 10 cm). (B) Características señales de hibridación en forma de anillo de Planctomycetes en una muestra de agua del lago Vollstedter Ver hibridado con PIR1223 sonda. (Bar, 5 cm). (C) Las células detectadas con RB454 en una muestra de agua del fiordo de Kiel. ( bar, 10 cm).




Referencia:
Fuerst, J. A. (2013). Planctomycetes: Cell Structure, Origins and Biology. New York: © Springer Science+Business Media.